Työ 17: Syljen amylaasin toiminta

Työ 17: Syljen amylaasin toiminta

Ruuan ravintoaineiden hajotus alkaa suussa syljen amylaasientysyymin vaikutuksesta. Syljen eritys on pääasiassa autonomisen hermoston säätelemää mutta osittain myös hormonaalista. Amylaasientsyymiä erittyy myös ohutsuoleen haimasta. Amylaasi alkaa pilkkoa polysakkarideja, kuten tärkkelystä, lyhytketjuisemmiksi monosakkarideiksi.

Harjoitustyön vaiheet:

          1. pH-sarjan valmistus puskureista koko ryhmälle

Valmistetaan puskureista pH-sarja työvihkon (Eläinfysiologian harjoitustyöt 755318) sivun 50 taulukon mukaan. Koko ryhmälle tehdään vain yksi pH-sarja. Sarjan tekemiseen tarvitaan yhteensä kahdeksan putkea. Jokaisen putken pH-arvo on eri, ja arvot vaihtelevat pH 4.2–8.0 välillä.

  2.  Sylkiliuoksen valmistus

Sylkiliuos valmistetaan huuhtomalla suu pariin kertaan 0.9 % NaCl-liuoksella. Suolaliuosta purskutellaan suussa noin parin minuutin ajan. Purskuteltu aine syljetään puhtaaseen kertakäyttömukiin, josta otetaan automaattipipetillä 1 ml sylkeä. Tämä sylki laimennetaan NaCl-liuoksella seuraavasti: 1:4 (1 ml sylkiliuosta + 4 ml NaCl-liuosta).

 3.  Puskuriliuosten pipetointi

Otetaan kahdeksan pientä putkea, jotka soveltuvat monikärkipipetin kanssa työskentelyyn. Pipetoidaan 1 ml kutakin valmistettua puskuriliuosta aina yhteen putkeen niin, että yhteen pieneen putkeen tulee ainoastaan yhtä puskuriliuosta.

4. Kuoppalevy ja Lugol-neste

Otetaan yksi kuoppalevy, ja lisätään jokaiseen kuoppaan Lugol-pisara (50 µl). Lugol-reagenssi reagoi ainoastaan polysakkaridien kanssa, jonka seurauksena nesteestä muodostuu sinistä.

  

5. Puskuriliuokset + tärkkelysliuos + sylkiliuos

Pieniin puskuriliuosta sisältäviin putkiin lisätään 100 µl tärkkelysliuosta, jonka jälkeen putkista pipetoidaan monikärkipipetillä pisara (50 µl) kuoppalevyn ensimmäiseen kuoppariviin vertailunäytteiksi. Tämän jälkeen jokaiseen pieneen putkeen pipetoidaan vielä 50 µl sylkiliuosta. Sen jälkeen putket suljetaan ”nauhalla” ja sekoitetaan.

6. Pipetointi kuoppalevylle

HETI sekoittamisen jälkeen laitetaan sekuntikello käyntiin, ja aloitetaan pipetoimalla monikärkipipetillä sylki-tärkkelys-puskuriliuoksesta pisara (50 µl) kuoppalevyn toiseen kuoppariviin. Seuraavat pipetoinnit seuraaviin kuoppariveihin tehdään, kun aikaa sekoituksesta on kulunut 0 s, 30 s, 1 min, 1.5 min, 2 min, 3 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min ja 13 min (kunnes jokaisesta putkesta saadaan kuoppalevyllä negatiivinen värireaktio).

Tulos:

Kokeen tulokset ovat luettavissa kuoppalevyn värimuutoksista. Kellertävä Lugol-reagenssi reagoi polysakkaridien kanssa muuttaen liuoksen siniseksi, ja syljen amylaasin hajottaessa polysakkaridit monosakkarideiksi Lugol-reagenssin ja polysakkaridien välistä reaktiota ei tapahdu. Syljen amylaasin toimii parhaiten lähes neutraalissa pH:ssa, ja selkeimmät tulokset saatiin pH 6.6 – pH 7.0 Näissä liuoksissa värimuutosta ei tapahtunut, jos amylaasi oli ehtinyt vaikuttaa tarpeeksi kauan (n. 2 min. à) – liuos pysyi tällöin kellertävänä. Happamassa liuoksessa (pH n. 4-6) amylaasi ei toiminut eikä näin ollen pystynyt hajottamaan polysakkarideja, minkä seurauksena liuos muuttui siniseksi. Sama reaktio oli havaittavissa emäksisemmissä (pH n. 7.4 – 8.0) liuoksissa.

(Seuraavassa kuva vielä viime syksyn harjoituksista..)