Työ 15: Kalan hapenkulutuksen määrittäminen

 

 

Työn taustaa

 

Aineenvaihdunta eli metabolia on biologinen prosessi, jossa ravintoaineita muokataan, jotta saataisiin energiaa ja rakennusaineita solun tai eliön käyttöön. Metabolisia prosesseja on kahdenlaisia: anabolisia ja katabolisia.

Hiilihydraatit, lipidit ja proteiinit ovat elimistön tärkeimmät energianlähteet. Metabolialla tarkoitetaan kaikkia elimistön kemiallisia reaktioita, sekä energian muutoksia, joita tapahtuu eliössä. Katabolia on prosessi, joka vapauttaa energiaa pieninä määrinä. Se voi ilmetä esimerkiksi lämpönä ja ulkoisena työnä. Energiaa voidaan taas varastoida elimistöön eri muotoihin kuten rasvaksi, runsasenergisiin fosfaattiyhdisteisiin, proteiineihin ja monimutkaisiin, yksinkertaisista molekyyleistä syntetisoituihin hiilihydraatteihin. Muodostumisprosessia jossa energiaa sidotaan lopputuotteisiin kutsutaan anaboliaksi.

Yksinkertaisin mutta kuitenkin riittävän luotettava tapa mitata eläimen energiantuotantoa epäsuorasti on hapenkulutuksen mittaaminen aikayksikössä. Mittaus voidaan suorittaa myös hiilidioksidin tai proteiinikatabolian lopputuotteita mittaamalla.

Hengitysosamäärä RQ tarkoittaa elimistön aikayksikössä tuottaman hiilidioksidin ja kuluttaman happimäärän suhdetta. Sen avulla voidaan tehdä päätelmiä eläimen käyttämästä ravinnosta ja perusaineenvaihdunnasta. Yksittäisten elinten välillä on myös eroja RQ osalta. Esim. aivojen RQ on 0.97-0.99, mikä tarkoittaa sitä, että aivot käyttävät pääasiassa hiilihydraatteja polttoaineenaan.

Tarvittavat välineet:

vesivarastopullo, eläinkammio, kumiletkuja, 2 letkunpuristinta, pumppu, statiivi, 5 Winklerin-näytepulloa(100ml), byretti, mittalasi

Aineet ja liuokset:

-liuos A: 33g NaOH + 10 k KI/100 ml vettä

-liuos B: 40 g MnCl2/ 100ml vettä

- 1% tärkkelystä

- 0.01 N natriumtiosulfaattia

Koe-eläin: Ruutana

Työvaiheet

 

Työn tarkoituksena määrittää X eli tässä tapauksessa koe-eläimenä toimivan ruutanan hapenkulutus aikayksikössä (ml/min). Tässä työssä määrittäminen tapahtuu Winklerin menetelmällä.

Kuva 1:  Kokeen suorittamista varten on rakennettu valmiiksi kuvanmukainen laitteisto. 

Kuva 2: Kellon ja letkunpuristimen avulla säädetään kalakammion läpi virtaavan veden määrä 50ml/min.

Työvaihe 1. Alkuvalmistelut. Kuten kuvasta 1 nähdään kokeen suorittamista varten on opiskelijoita varten rakennettu valmiiksi seuraava laitteisto. Vasemmalla on vesisäiliö, johon on moottoripumpun avulla puhallettu ilmaa n. 15 minuutin ajan. Pullosta lähtee kaksi letkua, joista toinen menee säiliöön, jossa koe-eläin sijaitsee ja toinen varastopulloon. Tästä varastopullosta otetaan kontrollinäytteitä, joiden avulla määritetään vesisäiliön happimäärä kokeen alussa (K1) ja kokeen lopussa (K2). Koe-eläin ruutana on vedellä täytetyssä kalakammiossa, josta lähtee puolestaan näytepulloon letku. Tästä letkusta otetaan näytteet N1, N2, N3, joiden avulla määritetään kuinka paljon kala on kuluttanut happea vedestä, joka on tullut kalakammioon vesisäiliöstä.

Kellon ja letkunpuristimen avulla (kuva 2) säädetään kalakammion läpi virtaavan veden määrä n. 50ml/min. Kala on ollut peitettynä katseilta, jotta se saa rauhoittua ennen kokeen suorittamista, koska hermostunut ja liikkuva kala kuluttaa enemmän happea, tämä toisi kokeeseen epäluotettavuutta.

Kuva 3. Näytettä N3 varten veden annetaan virrata kalakammiosta pulloon viidentoista minuutin ajan, jonka jälkeen letku vedetään varovasti pois pullosta ja korkki suljetaan. 

 Kuva 4. Viimeisenä näytteenä otetaan toinen kontrollinäyte K2 vesisäiliön happimäärän määrittämiseksi kokeen päättymisen jälkeen.

Työvaihe 2. Näytteiden ottaminen. Kun virtausnopeus on säädetty kohdilleen, otetaan ensimmäinen kontrollinäyte K1 letkusta, joka lähtee suoraan vesisäiliöstä. Veden annetaan virrata hetken yli pullosta, pullo suljetaan korkilla ja sivuletku suljetaan puristimella. Koska meitä opiskelijoita oli paljon kunkin näytteen ottaminen oli ohjeistettu tietylle parille/kolmikolle, joka pääsi heti näytteen ottamisen jälkeen siirtymään työvaiheeseen kolme. Seuraavaksi otetaan varsinaiset näytteet kalakammion jälkeisestä säiliöstä seuraavalla tavalla; näyttettä N1 varten veden annetaan virrata pulloon 5min, jonka jälkeen otetaan suoraan näyte N2 (kuva 2), jolloin vesi virtaa pulloon 15min. Viimeisenä otetaan näyte N3, jolloin vesi virtaa pulloon myös 15min. Aina kun näyte on saatu otettua, työpari siirtyy sen kanssa työstämään työvaihetta 3. Kontrollinäyte K2 (kuva 4) otetaan vielä viimeisenä kuten ensimmäinen kontrollinäyte K1. 

 Kuva 5. Kunkin näytteen ottamisen jälkeen happianalyysi aloitetaan pipetoimalla näytteeseen ensin liuosta A, sitten liosta B, joiden avulla kemiallisissa reaktioissa sidotaan vapaa happi näytteen pohjalle muodostuvaan sakkaan.

Kuva 6. Titrausta harjoitellaan ennen varsinaista työsuoritusta, jossa byretistä varovasti päästetään natriumtiosulfaattiliuosta, kunnes näytteen keltainen väri on melkein hävinnyt. 

 Kuva 7. Näytteeseen lisättiin muutama pisara tärkkelystä keltaisen värin häviämisen jälkeen, jolloin  näyte muuttui syvänsiniseksi.

Työvaihe 3: Happianalyysi. Työparin saatua määrätty näyte otettua työvaiheessa 2, he siirtyvät määrittämään näytteensä happipitoisuutta. Ensimmäisenä näytepullon pohjalle pipetoidaan 0,5ml liuosta A ja tämän jälkeen sama määrä liuosta B (kuva 5). Pullo suljetaan ilmatiiviisti ja sitä ravistellaan voimakkaasti. Vapaa happi sitoutuu kemiallisissa reaktioissa pullon pohjalle muodostuvaan sakkaan, jonka liuottamiseksi pulloon pipetoidaan vielä 3ml väkevää suolahappoa.Pullosta otetaan mittalasilla 50ml:n näyte erlenmeyerpulloon, joka titrataan 0,01 N natriumtiosulfaattiliuoksella, kunnes näytteen keltainen väri on melkein hävinnyt (kuva 6). Näytteeseen lisätään pari pisaraa (työparista riippuen tarvittiin 2-5 pisaraa), jotta liuoksen väri muuttuu syvänsiniseksi (Kuva 7). Titrausta jatketaan kunnes sininen väri on kokonaan hävinnyt. Kirjataan ylös määrä kuinka paljon titrauksiin yhteensä kului natriumtiosulfaattiliosta. Määrä kerrotaan vielä 1,12, jolloin saadaan veden happipitoisuus millilitroina litrassa NTP-olosuhteissa.

Työvaihe 4. Tulosten laskeminen. Kirjattujen tulosten perusteella lasketaan keskiarvo kontrollinäytteistä K1 ja K2 sekä varsinaisista näytteistä N1, N2 ja N3 ja näiden avulla varsinainen X eli kalan hapenkulutus tämän työn suorittamisen aikana aikayksikössä.

Tulokset

 

K1 =1,792	N1 = 4,256
K2 = 5,376	N2 = 5,04
	N3 = 2,072
XK = 3,584	XN = 3,789333

S = virtausnopeus = 56 ml/min = 3,36 l/h

mruutana = 85 g

Kalan hapen kulutus:

X = (XK – XN) · S = (3,584 – 3,789333) · 3,36 l/h = -0,68992 l/h

Lasketaan hapenkulutus kalan elopainoa kohti saadaksemme verrannollisia tuloksia

(-0,68992l/h x 20,1 J) / (3600S x 0,085kg)= -0,045318 W/kg

Kalan hapenkulutus ja siten myös energian kulutus ovat miinuksella, koska näytteiden N keskiarvo on suurempi kuin näytteiden K keskiarvo. Keskiarvon XK tulisi olla suurempi kuin XN, koska kala kuluttaa happea vedestä. 

Näytteiden K1 ja K2 lukemien välillä on suuri ero, vaikka tulosten olisi pitänyt olla lähes samat. Jos lukemat olisivat olleet enemmän lähellä toisiaan, keskiarvo XK olisi ollut suurempi. Silloin myös hapen- sekä energiankulutuksen tulokset olisivat olleet todenmukaisempia. Myös näytteiden N1, N2 ja N3 välillä on eroja. 

Jos käytetään laskuissa pelkkää N3 arvoa, tuloksista saadaan järkevämmät

XK =3,584

XN = 2,072

 

Hapenkulutus nyt:

X = (X_K – X_N) · S = (3,584 – 2,072) · 3,36 l/h = 5,08032 l/h

Energiankulutus nyt:

( 5,08032 l/h x 20,1J ) / (3600s x 0, 085kg) = 0,333703 W/kg

Työssä jokaista näytettä oli ottamassa eri työpari, mikä vaikuttaa tuloksiin. Näytteille tehtiin lisäksi happianalyysi, jonka eri vaiheissa saattoi myös tapahtua virheitä. 

Kirjoittajat: Ella, Satu, Vilma