Työ 4: Seerumin valkuaisaineiden kvantitatiivinen määritys biureettimenetelmällä

Tässä työssä määritettiin veriplasman valkuaisaine- eli proteiinipitoisuutta kvantitatiivisesti biureettimenetelmällä. 

Nisäkkäiden veriplasma sisältää suurimmaksi osaksi kolmenlaisia proteiineja, joita ovat albumiinit, globuliinit ja fibrinogeenit. Albumiinit (kuva 1) toimivat plasmassa kuljettajamolekyyleinä ja ne kuljettavat mm. rasvahappoja, kationeja, hormoneja ja lääkeaineita. Globuliinit (kuva 2) ovat vasta-aineita, jotka osallistuvat immuunipuolustukseen tunnistamalla esim. patogeenien tuottamia proteiineja eli antigeenejä. Fibrinogeeni osallistuu veren hyytymiseen.

Kuva 1. Ihmisen seerumin albumiinin kolmiulotteinen rakenne. Kuvan lähde: Protein Data Bank in Europe (2012)

Kuva  2. Ihmisen immunoglobuliini G B12 -vasta-aineen kolmiulotteiden rakenne. Kuvan lähde: Immunogenetics (2004)

Biureettimenetelmässä proteiineja sisältävään näytteeseen lisätään kuparisulfaattiliuosta, jolloin kupari-ionit muodostavat violetin värisen kompleksin reagoidessaan proteiinin peptidisidosten kanssa. Mitä enemmän näytteessä on peptidisidoksia, sitä voimakkaampi violetti väri näyteliuokseen muodostuu. Proteiinin määrä on suoraan verrannollinen värin voimakkuuteen, jolloin proteiinipitoisuus voidaan määrittää absorbanssimittauksen avulla.

Työ aloitettiin valmistamalla rinnakkaiset näytteet proteiinistandardista, jonka proteiinipitoisuus oli 58 g/l, ja veriplasmanäytteestä. Plasma oli erotettu valmiiksi verestä sentrifugoimalla hyytynyttä verinäytettä 10 minuuttia 2 000 g:n voimalla. Kuhunkin koeputkeen pipetoitiin 2,5 ml kuparisulfaattia sisältävää biureettireagenssia. Koeputkiin 1A ja 1B lisättiin 50 µl proteiinistandardia ja koeputkiin 2A ja 2B lisättiin 50 µl plasmanäytettä. Lisäksi valmistettiin nollanäyte, jossa oli 2,5 ml biureettireagenssia ja 50 µl tislattua vettä. Kuparisulfaatin annettiin reagoida peptidisidosten kanssa 25 minuuttia huoneenlämmössä.

Kuva 3. Näytteet ennen absorbanssimittausta 25 minuutin reagointiajan jälkeen.

Spektrofotometri nollattiin nollanäytteellä, jonka jälkeen näytteiden absorbanssit mitattiin aallonpituudella 555 nm. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin laskukaavalla c(näyte) g/l = A(näyte) / A(standardi) x c(standardi) g/l. Mittaustulokset ja näytteiden absorbanssien keskiarvot on kirjoitettu taulukkoon 1. 

Taulukko I. Absorbanssimittauksen tulokset ja niiden perusteella määritetty kokonaisproteiinipitoisuus veriplasmassa.

Näyte	Absorbanssi (555 nm)	Absorbanssien keski-arvo	pitoisuus (g/l)
1A (standardi)	0,308	0,311	58
1B (standardi)	0,314
2A (veriplasmanäyte)	0,329	0,359	67
2B (veriplasmanäyte)	0,388

Veriplasman kokonaisproteiinipitoisuudeksi saatiin määritettyä 67 g/l. Nisäkkäiden veren kokonaisproteiinipitoisuuden viitearvo on noin 50-90 g/l, joten saatu tulos vaikuttaa olevan todenmukainen. 

Lähteet:

Eläinfysiologian harjoitustyöt 755318 (2016) Heimonen Kyösti, Hohtola Esa, Honkanen Henrika, Mänttäri Satu, Nuutila Juha, Pyörnilä Ahti ja Saarela Seppo, Biologian koulutusohjelma, Oulun Yliopisto

Haefliger, Denise Nardelli; Moskaitis, John E.; Schoenberg, Daniel R.; Wahli, Walter (October 1989). "Amphibian albumins as members of the albumin, alpha-fetoprotein, vitamin D-binding protein multigene family". Journal of Molecular Evolution. 29 (4): 344–354.

Schoentgen, Francçoise; Metz-Boutique, Marie-Hélène; Jollès, Jacqueline; Constans, Jacques; Jollès, Pierre (June 1986). "Complete amino acid sequence of human vitamin D-binding protein (group-specific component): evidence of a three-fold internal homology as in serum albumin and α-fetoprotein". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 871 (2): 189–198.

Lichenstein, HS; Lyons, DE; Wurfel, MM; Johnson, DA; McGinley, MD; Leidli, JC; Trollinger, DB; Mayer, JP; Wright, SD; Zukowski, MM (8 July 1994). "Afamin is a new member of the albumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D-binding protein gene family.". The Journal of Biological Chemistry. 269 (27): 18149–54.

Charles Janeway (2001). Immunobiology. (5th ed.). Garland Publishing.

Litman GW, Rast JP, Shamblott MJ, Haire RN, Hulst M, Roess W, Litman RT, Hinds-Frey KR, Zilch A, Amemiya CT (January 1993). "Phylogenetic diversification of immunoglobulin genes and the antibody repertoire". Mol. Biol. Evol. 10 (1): 60–72.

Ferdinand Rose (1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden" (On the compounds of albumin with metal oxides), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie, vol. 104, pages 132-142.

G. Piotrowski (1857) "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" (A new reaction of proteins and their related derivatives) Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften in Wien, mathematisch-naturwissenschaftliche Classe (Proceedings of the Imperial Academy of Philosophies in Vienna, mathematical-natural sciences section), vol. 24, pages 335-337.

Protein Data Bank in Europe (2012), Crystal Structure of human Serume Albumin, EMBL-EBI, [luettu 29.9.2016] saatavissa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/1ao6

IMTG Lexique (2004), Glycosylation, Immunogenetics [luettu 29.9.2016], saatavissa: http://www.imgt.org/IMGTeducation/IMGTlexique/G/Glycosylation.html